Аннотация:

Третья часть - о том, какие вопросы, возникшие с открытием siRNA, все еще остаются без ответов.

Существенный недостаток предполагаемой siRNA - терапии у человека - ее кратковременность. Ведь siRNA действуют не на сами гены (ДНК), а только лишь на их продукты - мРНК, и у человека нет той системы усиления сигнала, о которая присуща растениям (этапы 5-7 на рисунке 1). Кроме того, двухцепочечные молекулы siRNA чрезвычайно неустойчивы и недолговечны, поэтому эффект терапии закончится, как только они разрушатся и будут выведены из клетки. Для того, чтобы продлить терапию, придется вводить все новые siRNA.

Генная терапия старается решить эту проблему, создавая специальные генетические конструкции на основе вирусных или бактериальных ДНК, в которые включены и гены, кодирующие необходимый для лечения тип siRNA. При попадании в клетку такие конструкции встраиваются в хромосому, а гены siRNA превращаются в собственно молекулы РНК с помощью клеточного механизма транскрипции. Таким образом, клетка сама получает возможность постоянно продуцировать новые и новые siRNA. Данные подходы уже опробованы и показали свою эффективность "в пробирке".

Но самым главным препятствием на пути разработки лекарств из siRNA являются сложности с их доставкой в нужные клетки внутри целого организма (их называют клетками - мишенями).

Во-первых, в крови на них действует первый эшелон защиты организма, ферменты - нуклеазы, которые разрезают потенциально опасные и необычные для нашего организма двойные цепочки РНК. Во-вторых, несмотря на свое название, малые РНК все же достаточно длинны, а, главное, они несут электростатический заряд, что делает невозможным их пассивное проникновение в клетку. И в - третьих, один из самых главных вопросов состоит в том, как заставить siRNA работать (или проникать) только в определенных ("больных") клетках, не затронув при этом здоровых?

Все поставленные выше вопросы появились задолго до открытия siRNA, и их преодоление критически важно не только для терапии siRNA, но и для генной терапии вообще.

В их решении уже сейчас достигнут некоторый прогресс. Например, ученые пытаются путем химических модификаций сделать молекулы siRNA более липофильными, то есть способными растворяться в жирах, из которых состоит клеточная мембрана, и таким путем облегчить проникновение siRNA внутрь клетки. А чтобы обеспечить специфичность работы внутри только лишь определенных тканей, генные инженеры включают в состав своих конструкций специальные регуляторные участки, которые активизируются и запускают считывание информации, заключенной в подобной конструкции (а значит, и siRNA, если она туда включена), только в клетках определенных тканей.

Большинство экспертов сходится во мнении, что терапия малыми РНК вряд ли станет панацеей от вирусов и рака. Однако создание на ее базе пусть даже не радикального, но все же действенного лекарственного средства будет очень важным шагом на пути разработки методов генной терапии. Можно сказать, что терапия siRNA - это примерочный этап, на котором задачей экспериментаторов является отработка оптимальных условий целенаправленной доставки биомолекул в клетки пораженных тканей.

И все же разработка лекарств, несмотря на всю свою значимость, - не самая главное из предполагаемых "занятий" siRNA. Самым важным направлением в использовании их свойств считают бурно развивающуюся в последнее время функциональную геномику. После описания геномов многих животных и человека перед наукой встала очередная глобальная задача: выяснить роль каждого гена. Одним из основных инструментов, применяемых генетиками для решения этого вопроса, является "выключение" гена. Действительно, чтобы хотя бы в первом приближении оценить функцию гена, нужно посмотреть, как поведет себя клетка без него, какие биохимические процессы при этом нарушатся.

Вот здесь - то siRNA явились для генетиков неоценимым подарком. Если раньше на поиски удачного способа блокировки гена и приведение его в действие требовалось от нескольких месяцев до года, то с помощью метода siRNA практически с любым геном любого организма, последовательность нуклеотидов которого известна, эту процедуру можно проделать в 1-2 недели, при этом значительно повысив специфичность блокирования. Действительно, у генетиков и молекулярных биологов есть повод для радости.

Выше мы рассмотрели в основном возможности для "искусственного" применения siRNA для исследовательских и медицинских целей. Но если огромные возможности для практического использования siRNA в науке и медицине более-менее очевидны, то с ее "нормальной" ролью в процессе жизни клеток пока остается больше вопросов, чем ответов. Как предполагают, роль коротких РНК в клетке не ограничивается только лишь защитой от вирусов и других чужеродных РНК. Они, оказывается, были созданы, чтобы защитить нас... от нас самих.

Дело в том, что геном любого многоклеточного организма включает в себя множество элементов, которые когда-то были привнесены в него в процессе эволюции извне, например как результат встраивания вируса. Судите сами: из всего материала, содержащегося в наших с вами хромосомах, 34% приходится на долю элементов, называемых LINEs и SINEs (соответственно, Long и Short Interspersed Nuclear Elements), о функциях которых известно только то, что они могут по временам копировать себя и перемещаться с одного места хромосомы на другое; те участки ДНК, которые достались нам от ретровирусов (8% генома) и транспозоны (3%) также способны менять свое место в геноме. На их фоне всего лишь 2 (два(!)) процента собственно генов, кодирующих наши клеточные белки, кажутся такой же маловажной деталью, как и siRNA среди огромного разнообразия своих больших "сестер".

LINEs, SINEs, остатки вирусной ДНК и транспозоны, за свою способность к перемещениям именуемые подвижными, или мобильными элементами генома, представляют значительную опасность для наших хромосом. "Чужие среди своих", они при определенных обстоятельствах могут поднять бунт и привести к внутриклеточному хаосу. Некоторые из них - остатки вирусов, или протоонкогены - способны при "включении" вызывать рак; мобильные элементы, размножаясь и перемещаясь, меняют структуру хромосом, что может привести к мутациям. Например, у излюбленного объекта генетических исследований - плодовой мушки дрозофилы - более 80% спонтанных мутаций возникают именно из-за "хулиганского" поведения ее собственных мобильных элементов. Их перемещения внутри генома так индивидуальны и непредсказуемы, что положение некоторых из них может служить "молекулярным паспортом", точно определяющим личность хозяина, что уже используется на практике.

Понятно, что каждому организму необходимо было разработать систему жесткого контроля за поведением мобильных элементов. Как раз эту "надзирательскую" функцию, как полагают ученые, и выполняет система внутриклеточных siRNA. На модели все того же C. elegans, например, было показано, что отключение генов, кодирующих некоторые из малых РНК, ведет к активизации перемещений мобильных элементов в его хромосомах и, соответственно, к повышению уровня мутаций.

Кроме того, ошибки в развитии органов и тканей при отключении генов, кодирующих систему siRNA у подопытных животных, а также ее активность в "незрелых" клетках указывают на то, что механизм РНК - интерференции активно участвует в регуляции программы "созревания" клеток и, как следствие, может играть одну из ключевых ролей в формировании целостного организма.

Еще одна из предполагаемых нормальных функций siRNA - отслеживание неправильно обработанных копий других типов РНК в клетке.

Наконец, в 2002 году исследователи неожиданно выяснили, что действие siRNA может не ограничиваться только лишь временным выключением генов не уровне РНК. Имеются показания, что в некоторых случаях siRNA, видимо, воздействует прямо на ДНК, изменяя структуру хроматина и способствуя длительному "замолканию" одних, и, возможно, активизации других генов.

Как осуществляются все эти функции siRNA, каковы их молекулярные детали? Откуда, например, может появляться та необходимая для запуска реакции РНК - интерференции молекула двухцепочечной РНК? Если она создается в клетке намеренно, то какие ферменты отвечают за ее создание? Какие свойства сигнализируют о том, что молекула одноцепочечной РНК "не своя" или ошибочная и подлежит уничтожению? Каковы особенности функционирования системы siRNA у разных организмов, и почему они возникли именно в таком виде? Как появляются siRNA в клетке млекопитающих, у которых пока не выявлены ферменты, ответственные за достраивание второй цепочки siRNA?

На эти и многие другие вопросы ответов пока нет. Каждый новый вопрос заставляет будущих профессоров и академиков, Нобелевских лауреатов и призеров Science искать на ответ только лишь затем, чтобы задать новые вопросы следующим поколениям.