Разработан новый оптический метод, позволивший увидеть неизвестные ранее тонкости в процессе транскрипции ДНК.

Генетический код, определяющий аминокислотные последовательности всех белков клетки, реализуется в два этапа. Первый этап – это синтез молекул РНК на цепочке ДНК, как на матрице, или, как его еще называют, транскрипция ДНК. После этого на РНК-копии гена запускается синтез белка.

Молекула рибонуклеиновой кислоты (РНК) химически очень похожа на ДНК: она тоже является полимером, составленным из нуклеотидов. В синтезе РНК участвует специальный фермент РНК-полимераза, который узнает специальную последовательность нуклеотидов между генами (промотор). К промотору прикреплен еще один белок, называемый «фактор инициации транскрипции», с которым связывается РНК-полимераза. Двигаясь вдоль гена, РНК-полимераза снимает с него копию в виде молекулы РНК.

Для изучения такого типа многостадийных процессов, включающих взаимодействие белков и нуклеиновых кислот, обычно используется метод FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии). В этом методе две флуоресцентные молекулы (флуорофоры) генетически присоединены к двум выбранным белкам, что позволяет наблюдать их во флуоресцентный микроскоп. Обычная (не FRET) флуоресценция - это излучение флуорофором света после облучения его светом определенной частоты. Каждое вещество-флуорофор характеризуется спектром поглощения и спектром испускания флуоресценции. Частота испускаемого света как правило меньше частоты возбуждающего излучения. Для получения FRET-эффекта частота испускания первого флуорофора, то есть донора, должна равняться частоте поглощения второго флуорофора - акцептора. Если теперь облучать клетку с флуоресцентно-меченными белками лазерным светом с частотой возбуждения донора, то в микроскопе будет виден только первый белок, до тех пор пока белки не сблизятся. Тогда часть энергии флуоресценции первого белка будет поглощать акцептор, и сам начнет излучать свет. Комплекс двух белков будет виден в микроскопе как точка другого цвета (см. рис.1).

Рис.1. Схема метода FRET на примере визуализации связывания кальмодулина с микротрубочками.

Эффективность переноса энергии от донора к акцептору падает пропорционально шестой степени расстояния между ними, и резонансный перенос энергии осуществляется, когда флуорофоры находятся на расстоянии 2-10 нанометров друг от друга. Таким образом, метод FRET позволяет наблюдать макромолекулы в момент их тесного взаимодействия, а по разнице между интенсивностями излучения двух флуорофоров можно определить расстояние между ними.

Ученые из Инстиута Биофизики Ливерморской национальной лаборатории Лоренса (Lawrence Livermore National Laboratory's Physical Biosciences Institute), Калифорния, использовали метод FRET в изучении процесса транскрипции. Группа исследователей во главе с Тэдом Лоуренсом разработала усовершенствованную технику переменного возбуждения лазером ALEX, позволяющую регистрировать FRET с лучшим разрешением. С помощью этой техники наблюдался перенос энергии от фруорофора-донора на РНК-полимеразе к флуорофору-акцептору на цепочке ДНК и на ассоциированных с ней белках. Ученым удалось обнаружить, что в механизмах запуска и завершения синтеза РНК нет существенных различий. Исследования впервые наглядно подтвердили тот факт, что «фактор инициации транскрипции» остается связанным с РНК-полимеразой в течение всего процесса синтеза. Это означает, что клетка не использует дополнительных взаимодействий для завершения трансляции, но синтез РНК регулируется на протяжении всего времени от начала до его окончания.

Работа опубликована в журнале Molecular Cell, ноябрь (11), 2005г.

Источник Bio.com

М.Ахманова